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副猪嗜血杆菌河南分离株的分离鉴定及药敏试验

所属栏目:细菌性病 文章来源:三五养猪网 发布时间:2019-04-25 16:00:15 字号切换:T|T

  副猪嗜血杆菌(HPS) 是一种多形态、非溶血性、不运动、NAD 依赖型、革兰氏阴性细小杆菌,属于巴斯德杆菌科嗜血杆菌属。副猪嗜血杆菌只感染猪,有很强的宿主特异性,可以影响2 周龄到4 月龄的青年猪,主要在断奶后保育舍阶段发病,感染高峰通常见于保育期的4 ~ 6 周,发病率一般在10% ~ 15%,严重时病死率可达50%。副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起的猪的一种以急性败血症、多发性浆膜炎和关节炎为特征的细菌性传染病。该病为继发性疾病,常在蓝耳病病毒、圆环病毒等病毒感染后激发带菌猪和慢性感染猪发病,成为本病的传染源,病原菌主要存在于猪的上呼吸道,通过猪之间的接触、空气飞沫及污染物而传播。在集约化猪场中, 当猪群遭受环境不良、转群、去势、免疫注射、饲养不当等应激因素影响, 或者猪群感染猪繁殖与呼吸综合征等免疫抑制性疾病时, 副猪嗜血杆菌病伺机暴发, 造成严重的经济损失 。目前, 该病已成为全球范围内影响养猪业的典型细菌性疾病。

  在特定的条件下引起猪的多发性浆膜炎和关节炎,主要临床症状为发热、食欲不振、厌食、反应迟钝、咳嗽、呼吸困难、疼痛( 尖叫)、关节肿胀、跛行、颤抖、共济失调,可视黏膜发绀、侧卧、消瘦和被毛凌乱随之可能死亡。种猪急性感染后可能留下后遗症,即母猪流产,公猪慢性跛行。特征性病理变化为胸腔、腹腔浆膜及肺部炎症,胸腔内有大量的淡红液体及纤维素性渗出物。肺表面覆盖有大量的纤维素性渗出物并与胸壁粘连,多数为间质性肺炎,部分有对称性肉变。各脏器有不同程度的出血、淤血和坏死。镜检渗出物中有大量纤维蛋白、中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞和单核细胞。实质细胞呈现不同程度的颗粒变性、水泡变性和坏死,实质和间质可见充血、出血、炎性细胞浸润、纤维性渗出和水肿液蓄积。

  近年来,副猪嗜血杆菌病在国内猪场引起多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜,其发病率和死亡率日渐升高。为此,本实验对河南省内疑似病例进行病原分离培养,以对本病药物防控中药敏检测及其灭活菌苗研制奠定基础;本实验还采用病原学和生化鉴定诊断, 并进行药敏试验, 以期为该病的诊治提供临床依据。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  1.1.1 病料采集

  对河南某猪场的15 头疑似副猪嗜血杆菌感染的病仔猪进行病理剖检。无菌条件下抽取心血、心包液和腹水,并采集病变明显的肺、心、肾脏等病料进行病原学检查。

  1.1.2 菌种与主要培养基

  金黄色葡萄球菌,各种药敏试纸片(左旋氧氟沙星、恩诺沙星、磺胺间甲氧嘧啶、乳酸环丙沙星、氟苯尼考、头孢噻呋钠、克林霉素、硫酸庆大霉素、氟哌酸、替米考星、阿莫西林、盐酸林可霉素、氨苄西林、青霉素钾等);烟酰胺嘌呤二核苷酸、美兰染色、革兰氏染色、HE 染色试剂,普通营养琼脂平板、麦康凯培养基、绵羊鲜血琼脂平板、加NAD 的巧克力琼脂平板和TSA 培养基、TSB 液体培养基均自制。

  1.1.3 生化鉴定微量发酵管及试剂

  葡萄糖发酵管、蔗糖发酵管、甘露糖发酵管、木糖发酵管、棉籽糖发酵管、甘露醇发酵管、硫化氢微量发酵管,氧化酶、3% 过氧化氢、硝酸盐培养基。

  1.2 方法

  1.2.1 细菌的分离培养

  无菌操作条件下, 采集病猪的心血、心包液、腹水、肺、心、肾脏等病料,首先划线接种于含NAD 的巧克力琼脂平板或TSA 培养基上,37 ℃培养48 h,然后挑取单个菌落进一步纯化培养。

  1.2.2 染色镜检

  将培养后的单个疑似菌落涂片,进行美兰染色和革兰氏染色, 镜检,观察菌体形态及染色特性。

  1.2.3 培养特性

  取疑似副猪嗜血杆菌菌落分别接种于普通营养琼脂平板、麦康凯培养基、绵羊鲜血琼脂平板、含NAD 巧克力琼脂平板和TSA 培养基,37℃恒温培养48 h, 观察菌落的生长情况。

  1.2.4 生化鉴定

  糖类分解试验:取纯培养后的细菌分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管内,倒置于洁净的小烧杯内,置灭菌培养皿中。37 ℃培养24 h,观察并记录结果。结果判断:无变化,培养液仍为紫色,阴性反应;产酸,培养液为黄色及产酸又产气,培养液变黄,并有气泡,阳性反应。

  硫化氢试验:取纯培养的细菌接种于硫化氢微量发酵管,置于37 ℃培养24 h 后观察,培养液黑色者为阳性,无色者为阴性。

  氧化酶试验:加2 ~ 3 滴试剂于滤纸上,用牙签挑取1个菌落到纸上涂布, 观察菌落反应。阳性反应在5 ~ 10 s 内由粉色到黑色,15 min 后可出现假阳性反应。也可以将试剂滴在细菌的菌落上,菌落成玫瑰红然后到深紫色者为阳性。

  触酶试验:可用接种环将菌落放于载玻片的中央,加1 滴3% 过氧化氢于菌落上,立即观察有无气泡出现;也可以直接将3% 过氧化氢滴加到菌落上观察有无气泡出现。

  硝酸盐还原试验:把纯菌接种到硝酸盐培养基中,在37 ℃ 培养18 ~24 h,再加试剂甲(对氨基苯磺酸0.8 g+5 mol/L 醋酸100 mL)和乙(α-奈胺0.5g +5mol/L 醋酸100mL) 各3 ~ 5 滴,在30 s 内出现红色即为阳性。若无颜出现,加少量锌渣,随后出现红色则是真正的阴性试验。

  1.2.5卫 星现象观察

  挑取经纯化培养的可疑菌落, 于绵羊鲜血琼脂平板上水平画线,再挑取金黄色葡萄球菌垂直划线,37 ℃培养24 ~ 48 h, 观察是否有卫星生长现象。

  1.2.6 动物试验

  将纯化菌接种于TSB 液体培养基,18 h 后经菌落计数,将培养液稀释成每毫升含2×105 个菌,皮下注射0.2 mL稀释液于小白鼠。

  1.2.7 药敏试验

  将培养纯化的菌种均匀涂布于含NAD 的巧克力培养基上,然后按常规纸片法,将各种药敏试纸片(左旋氧氟沙星、恩诺沙星、磺胺间甲氧嘧啶、乳酸环丙沙星、氟苯尼考、头孢噻呋钠、克林霉素、硫酸庆大霉素、氟哌酸、替米考星、阿莫西林、盐酸林可霉素、氨苄西林、青霉素钾等)贴于平板上,37 ℃恒温培养18 ~ 24 h,观察抑菌圈大小。

  判定标准: 抑菌圈直径大于15mm 为高度敏感;抑菌圈直径在10 ~ 15 mm 之间为中度敏感;抑菌圈直径小于10 mm 为耐药。

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